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Keywords：原代肝細(xì)胞,；Primary Hepatocytes; 肝細(xì)胞分離；肝細(xì)胞提取; Hepatocyte Isolation Protocol,；Isolation of Primary Hepatocytes

肝臟作為藥物暴露的主要器官,，在藥物的代謝和毒性過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）具有完整的細(xì)胞特性和生理水平的酶和輔助因子，既包括膜結(jié)合酶【如細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450）混合功能氧化酶】,，也包括胞質(zhì)酯酶,，擁有肝臟中所有的代謝途徑。因此,，原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）被廣泛認(rèn)為是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn),，在藥物相互作用、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的青睞,。

一,、原代肝細(xì)胞分離方法

肝細(xì)胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細(xì)胞提取提取有直接剪切法、組織塊培養(yǎng)法,、胰蛋白酶消化法,、兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）、半原位膠原酶灌注法等,。

【直接剪切法】

原理：將肝臟切成小塊,，然后用膠原酶或胰蛋白酶進(jìn)行消化，分離得到肝細(xì)胞,。

優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，適用于大量細(xì)胞的分離,。

缺點(diǎn)：細(xì)胞損傷較大,，純度較低。

【組織塊培養(yǎng)法】

原理：將肝臟切成小塊,，在培養(yǎng)皿中加入含特定生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),，使組織塊貼壁生長(zhǎng)，然后逐漸分離得到肝細(xì)胞,。

優(yōu)點(diǎn)：能夠保持細(xì)胞的天然狀態(tài),，適用于長(zhǎng)期培養(yǎng)。

缺點(diǎn)：操作較為繁瑣,，細(xì)胞數(shù)量較少,。

【胰蛋白酶消化法】

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原理：用胰蛋白酶或胰酶對(duì)肝臟進(jìn)行消化，分離得到肝細(xì)胞,。

優(yōu)點(diǎn)：能夠較為徹-底地分解細(xì)胞間物質(zhì),，獲得較純的肝細(xì)胞。

缺點(diǎn)：胰蛋白酶的價(jià)格較貴,，成本較高,。

【兩步膠原酶灌注法（Seglen灌注法）】

原理：用含有膠原酶的溶液通過(guò)門靜脈灌注到肝臟中，使肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞與間質(zhì)分開(kāi),，然后收集分離得到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞,。

優(yōu)點(diǎn)：能夠保持細(xì)胞的天然狀態(tài)，適用于長(zhǎng)期培養(yǎng)。

缺點(diǎn)：操作較為繁瑣,，細(xì)胞數(shù)量較少,。

【半原位膠原酶灌注法】

原理：將肝臟放置在特定裝置中，通過(guò)門靜脈灌注膠原酶溶液,，使肝臟在生理狀態(tài)下進(jìn)行消化,，然后收集分離得到肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。

優(yōu)點(diǎn)：能夠較為真實(shí)地模擬生理狀態(tài),，獲得的細(xì)胞形態(tài),、活性較好。

缺點(diǎn)：操作較為復(fù)雜,，成本較高,。

其中，兩步膠原酶灌流法因其對(duì)肝細(xì)胞損傷作用較小,，肝細(xì)胞產(chǎn)率和存活率高,，成為了分離原代肝細(xì)胞的經(jīng)典方法。

二,、原代肝細(xì)胞分離流程

鑒于此,，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，在兩步膠原酶灌注的基礎(chǔ)上,，開(kāi)發(fā)了原代肝細(xì)胞分離試劑盒,，有標(biāo)準(zhǔn)的分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol），其內(nèi)整合了包括灌流液,、膠原酶,、細(xì)胞洗滌液、細(xì)胞純化液,、試驗(yàn)耗材等在內(nèi)的所有組分,，可適用于大鼠、小鼠等多個(gè)種屬原代肝細(xì)胞的分離,。以下為詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程：

1,、實(shí)驗(yàn)材料

1)動(dòng)物：空白健康的6~8周雄性SD大鼠

2)儀器：恒溫水浴鍋、水平離心機(jī),、移液器,、生物安全柜

3)試劑：膠原酶、灌流溶液A,、灌流溶液B,、消化終止液、分離液添加劑,、肝細(xì)胞純化液

4)耗材：0.22um過(guò)濾器,、20ml無(wú)菌注射器,、10ml無(wú)菌注射器、5ml無(wú)菌注射器,、無(wú)菌紗布,、無(wú)菌剪刀、無(wú)菌鑷子,、無(wú)菌燒杯,、無(wú)菌擦手紙、無(wú)菌50mL離心管及巴氏吸管

2,、試劑預(yù)處理

1)灌流溶液A：實(shí)驗(yàn)前37℃水浴預(yù)熱30分鐘,。

2)灌流溶液B：實(shí)驗(yàn)前每100mL灌流溶液B中加入1支膠原酶，充分溶解后用0.22µm過(guò)濾器過(guò)濾,。過(guò)濾后的溶液加入100uL分離液添加劑,，然后37℃水浴預(yù)熱30分鐘。

3)消化終止液：實(shí)驗(yàn)前在無(wú)菌條件下,，每100mL消化終止液中加入100uL分離液添加劑,，混勻后置于冰上備用。

3,、實(shí)驗(yàn)步驟及結(jié)果

(一)  肝臟獲取

1)盡可能于半分鐘內(nèi)將大鼠斷頸處死后用75%酒精噴灑進(jìn)行全身消毒,，并轉(zhuǎn)移至生物安全柜中。

2)用鑷子將大鼠下腹部皮膚提起,，并使用剪刀從下往上將大鼠腹部表皮剪開(kāi),，以裸露腹部肌肉部位。

3)更換剪刀將大鼠肌肉部位剪開(kāi),，使肝臟充分暴露,，注意不要將大鼠內(nèi)臟器官剪破,。

(二)  組織處理

1)用剪刀剪開(kāi)圖A所示位置,，剪至能清晰可見(jiàn)每葉肝臟上都有較為明顯的靜脈孔，使用20mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液A,，將每葉肝臟都灌注至土黃色,。

2)使用10mL注射器從靜脈孔處灌注灌流液B，直至肝臟軟爛,。

(三)  細(xì)胞獲取

1)用鑷子將肝臟摘下置于含10mL灌流溶液B液的50mL離心管中并用剪刀將其充分剪碎至泥狀,，補(bǔ)加灌流溶液B至30mL.

2)37℃水浴消化約3min,期間用巴氏吸管不斷攪拌。

3)消化結(jié)束后按照混懸液與消化終止液1：1的比例加入消化終止液,。

4)無(wú)菌紗布過(guò)濾即得肝細(xì)胞懸液,。

(四)  細(xì)胞洗滌

1)將肝細(xì)胞懸液輕輕顛倒混勻，分裝至50mL離心管,。

2)70g（升速 3,、降速 3）,、4℃離心 5min。

3)在超凈工作臺(tái)中棄上清,，消化終止液重懸細(xì)胞沉淀,。

(五)   細(xì)胞純化

1)按照 7：3 的比例（即細(xì)胞懸液：肝細(xì)胞純化液）加入肝細(xì)胞純化液并混勻。

2)100g（升速 3,、降速 3）,、4℃離心 10min。

3)棄上清,，使用凍存液將細(xì)胞重懸,，并于液氮罐中保存。

如圖所示,，該圖為IPHASE技術(shù)人員此次共分離得到的SD大鼠新鮮肝細(xì)胞照片,，經(jīng)0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活率在90%以上，且數(shù)量共有80million,，說(shuō)明以IPHASE原代肝細(xì)胞分離試劑盒為提取材料,，可獲得純度高、活率好且數(shù)量多的新鮮原代肝細(xì)胞,！

三,、IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，深刻識(shí)到原代肝細(xì)胞（Primary Hepatocytes）是構(gòu)建體外肝臟模型的金標(biāo)準(zhǔn),，在藥物相互作用,、藥物代謝和藥物毒性研究中受到研究者的廣泛青睞。因此,，在兩步膠原酶灌注法的基礎(chǔ)上研發(fā)了原代肝細(xì)胞分離試劑盒,，在標(biāo)準(zhǔn)的肝細(xì)胞分離流程（Hepatocyte Isolation Protocol）下進(jìn)行肝細(xì)胞分離（Isolation of Primary Hepatocytes）和肝細(xì)胞提取，并以SD大鼠為實(shí)例,，證明該試劑盒,、該方法具有實(shí)用性！除此以外,，IPHASE以相似分離流程,，研發(fā)、生產(chǎn)了多種屬,、多規(guī)格及多性別的懸浮或貼壁原代肝細(xì)胞,，供客戶購(gòu)買使用，為客戶縮短時(shí)間,，節(jié)約成本,！

IPHASE生產(chǎn)產(chǎn)品均具有以下優(yōu)勢(shì)：

合規(guī)性：生產(chǎn)產(chǎn)品的組織均由正規(guī)渠道獲得，來(lái)源清晰,。

安全性：生產(chǎn)組織均經(jīng)過(guò)病原檢測(cè),，保證產(chǎn)品質(zhì)量安全,。

高質(zhì)量：生產(chǎn)產(chǎn)品均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控，且同批次數(shù)量多,，批次間差異性小,。

可定制：可根據(jù)客戶特殊需求，提供特殊種屬肝細(xì)胞的定制服務(wù),。

發(fā)    文    章    得    獎(jiǎng)    勵(lì)

凡使用本公司產(chǎn)品,，在國(guó)內(nèi)及國(guó)際刊物上發(fā)表論文（論文發(fā)表日起一年內(nèi)），并注明產(chǎn)品屬于我司所有,，即可申請(qǐng)獎(jiǎng)勵(lì),。根據(jù)發(fā)表刊物影響因子不同，給予不同金額獎(jiǎng)品：

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